静态光片和技术难点
图1 L-SPIM:需要旋转至少四次才能完整成像
为了解决这个问题,科学家们做出了改进,使用两个相对的物镜进行双边照明,称为T-SPIM(图2)。T-SPIM扩大了有效视野,增加了成像速度。但深部的样品信号由于色散和散射特性,成像效果还是比较差。为了保证图像质量,仍需要将样品旋转180°。
图2 T-SPIM双向照明:旋转180°就能完整成像
或者使用两个成像物镜同时进行双边成像(mSPIM,图3)。通过旋转样品,将多角度的图像进行融合,可以得到在xyz方向上一致的分辨率,z轴分辨率可以提高3倍。
图3 mSPIM。双边照明和双边成像:对样品在0°和90°分别成像,融合之后产生各向相同的分辨率
图4 图像伪影。A)斑马鱼胚胎受精后32小时光片成像。B) 光片旋转后A中样品成像。C)色素或更大的荧光结构挡住了照明光。D)光片旋转后改善了这种情况。(Huisken & Stainier, 2009)
另外一个解决办法是将组织透明化(图5)。一个多世纪以来,研究者们不断开发出各种有机和无机溶剂,将更大的样品透明化,从而能够更深入更详细地研究样品结构。
图5 组织透明化(CLARITY法)。A)小鼠大脑透明化前B)透明化后(Chung et al.,2013)
另外,样品的固定也是光片显微镜的一大难题。要进行活体成像,样品必须固定在光学透明的培养基中,才不会影响成像,并且样品要方便进行旋转。从单个细胞到整个器官,样品固定方法五花八门,取决于研究人员的创造力和具体样品的需求 (图6A-D),这里我们就不进行详细讨论了。
图6 样品安装示例。A)固定在琼脂糖内的斑马鱼胚胎。B)挂钩固定的组织/器官。C)聚四氟乙烯管中的细胞球。D)附着在玻片上的细胞。(Reynaud et al. , 2015)
高斯光束扫描光片
图7 基于高斯光束扫描的L-SPIM光片
扫描光片和使用卷帘快门(rolling shutter)的sCMOS相机可以形成完美的配合。通过相机和扫描光束之间的同步,实现只有当前读取的行被激发光照射,杜绝了非成像区域的干扰信号,提高图像对比度和分辨率。Teledyne Photometrics sCMOS 相机内置的 Programmable Scan Mode (图8)就是专门为此而设计的(详情可阅读最下方阅读原文链接)。
图8 Programmable Scan Mode:同步相机曝光和扫描光片激发光
贝塞尔光束扫描光片
2011和2012年,诺贝尔奖获得者 Eric Betzig 教授研究组的 Planchon 和高亮等首先尝试用贝塞尔光束扫描来产生光片(图10)。光片的尺寸在整个长度上不会发生显著变化,从而进一步提高了有效视野和分辨率。
图9 A)高斯光束B)贝塞尔光束。Power & Huisken (2017)
图10 基于贝塞尔光束扫描的L-SPIM光片
晶格光片
与结构光照明(SIM)相结合,显著降低旁瓣能量的同时维持较薄的光片厚度,进一步提高图像空间分辨率
能够在极低的峰值激发功率下快速成像,光毒性更小
同时照亮整片样品,增加了有效视野,大大加快了成像速度(可达200fps)
图11 并行贝塞尔光束
配合大视野的高速sCMOS相机(如Teledyne Photometrics 公司的Prime BSI,Iris15等),Lattice Light-Sheet 非常适用于对活细胞进行4D成像。高速,高分辨率,低光毒性,意味着我们可以在更长的时间内记录细胞内的生理活动。
除了晶格光片显微镜之外,光片显微镜家族还有许多其他的兄弟姐妹,我们将在下一期中继续为大家介绍,请持续追番~
References
Chen,B.C. et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos athigh spatiotemporal resolution. Science346, 1257998 (2014).
Chung, K., Wallace et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. May 16;497(7449):332-7 (2013)
Fahrbach FO, Voigt FF, Schmid B, Helmchen F, and Huisken J, Rapid 3D light-sheet microscopy with a tuneable lens. Optics ExpressVol. 21(18): 21010-21026 (2013)
Huisken, J. & Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development.Jun;136(12):1963-75 (2009)
Planchon,T.A. et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Naturemethods 8, 417-423 (2011).
Power, R. M. & Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. Mar 31;14(4):360-73 (2017)
Reynaud EG, Peychl J et al. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. Jan;12(1):30-4 (2015)
Voie A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal- plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. Jun;170(Pt 3):229-36 (1993)